PROTOCOLO 01

SEPARACIÓN CELULAR

Dr. Nirk Quispe C.

Figura 1. Se observa la muestra de sangre periférica heparinizada (B), sobre el Ficoll (F) (A la izquierda). Luego de la centrifugación (a la derecha) obtenemos la separación celular, de arriba hacia abajo tenemos plasma (P), una capa transparente de monocitos y linfocitos (W) el Ficoll con los granulocitos y eritrocitos (R).

Es necesario para realizar los estudios funcionales de células mononucleares, el aislamiento de éstos a partir de muestras de sangre periférica, órganos linfoides u otros tejidos. Este aislamiento se puede realizar por varios métodos pero en esta ocasión vamos a hacer referencia a la “Separación por gradiente de densidad”, utilizaremos la centrifugación sobre una solución de densidad definida como es el Ficoll-Hypaque (Lymphoprep). El Ficoll es un polímero de carbohidrato y metrizamida (compuesto denso que contiene yodo) y que permite que se hundan los eritrocitos y los granulocitos (debido a su mayor densidad = 1.077), y que floten las células mononucleares (linfocitos y monocitos); por ello, que tras la centrifugación nos será fácil obtener las células mononucleares de sangre periférica para nuestro estudio (Fig. 1).

MATERIALES

• Tubos cónicos para centrífuga de 15 mL estériles (06 tubos)
• Tubo cónico de plástico de 50 mL estéril (01 tubo)
• Probetas de vidrio 50 mL (02)
• Ficoll-Hypaque (Lymphoprep™) (20 mL)
• Suero Fisiológico estéril (50 mL)
• Pipetas de 10 mL estériles
• Pipetas Pasteur de plástico estériles
• Parafilm
• Guantes de látex o vinilo estériles
• Bombilla de pipeteo (pipettus aid)
• Gradilla
• Centrífuga
• Campana de flujo laminar (en caso de no disponer de una, disponer de un ambiente donde trabajar con la máxima esterilidad posible)

PROCEDIMIENTO

1. Importante tener Ficoll-Hypaque a temperatura ambiente.


2. Durante todo el procedimiento trabajar con las máximas medidas de esterilidad y bioseguridad, de ser posible dentro de campana de flujo laminar o ambiente dispuesto para tal procedimiento.


3. Limpiar superficie de trabajo con etanol 70% y calzarse guantes y bata de laboratorio. Si no se trabaja en campana de flujo laminar utilizar además gafas como medida de seguridad contra salpicaduras de sangre.


4. Dispensar 20 mL de suero fisiológico en probeta de vidrio estéril y cubrir hasta su uso.


5. Dispensar 20 mL de Ficoll-Hypaque en probeta de vidrio estéril y cubrir hasta su uso.


6. Colocar los cuatro tubos cónicos de centrífuga en gradilla y dispensar 4 mL de Ficoll-Hypaque en cada tubo utilizando pipeta milimetrada.


7. En tubo de 50 mL aparte, mezclar 18 mL de sangre con 18 mL de suero fisiológico utilizando pipetas milimetradas.


8. Cargar 8 mL de sangre diluida con suero fisiológico en pipeta milimetrada y dispensar muy cuidadosamente y lentamente sobre el Ficoll-Hypaque en el tubo de centrifuga. Poner el tubo inclinado y apoyar la punta de la pipeta sobre la pared del tubo para dejar deslizar la sangre suavemente sobre el Ficoll y poder formar una interfase (Ficoll abajo y sangre arriba).


9. Repetir la acción en cada uno de los tubos de centrífuga que contienen Ficoll. Se puede utilizar la misma pipeta.


10. Cubrir todos los tubos y llevar a centrifugar.


11. Centrifugar a 1500 r.p.m. durante 30 minutos, a temperatura ambiente y sin freno al final de centrifugación.


12. Retirar cuidadosamente de la centrifuga y llevar a la gradilla. Verificar la formación de las fases de gradiente de densidad (arriba el plasma sanguíneo, debajo la banda de células mononucleares, debajo el Ficoll-Hypaque, debajo las células PMNs y debajo los eritrocitos aglutinados).


13. Extraer toda la banda de células mononucleares utilizando pipetas pasteur de plástico y dispensar en tubo de centrifugación nuevo. Dispensar las cuatro bandas en un único tubo de centrifugación y luego completar hasta 15 mL con suero fisiológico. Cubrir tubo y llevar a centrifugación.


14. Centrifugar con contrapeso a 1500 r.p.m. durante 10 minutos, a 4ºC pudiendo utilizar freno al final de la centrifugación.


15. Extraer tubo de la centrífuga sin agitarlo.


16. Decantar sobrenadante y resuspender células del fondo con un pulso de vórtex o con golpes con las yemas de los dedos.


17. Completar nuevamente hasta los 15 mL con suero fisiológico, cubrir tubo y llevar nuevamente a centrifugar igual que en el paso anterior.


18. Centrifugar con contrapeso a 1500 r.p.m. durante 10 minutos, a 4ºC pudiendo utilizar freno al final de la centrifugación.


19. Decantar sobrenadante y resuspender células del fondo con un pulso de vórtex o con golpes con las yemas de los dedos.


20. Agregar 2 mL de Medio de cultivo completo, cubrir tubo y agitar para resuspender células en el medio de cultivo.


21. Contar células.

Finalmente en el contaje de células es un paso importante porque es necesario tener ajustado el número de células a una cantidad de 1 millón de células por mL, el contaje se realiza en cámara de Neubabuer y con Azul de Tripán. Luego de tener ajustado el número de células se procede al cultivo de las células mononucleares para poder realizar los estudios funcionales de estos tipos celulares.