SEPARACIÓN CELULAR
Dr. Nirk Quispe C.
Es necesario para realizar los estudios funcionales de células mononucleares, el aislamiento de éstos a partir de muestras de sangre periférica, órganos linfoides u otros tejidos. Este aislamiento se puede realizar por varios métodos pero en esta ocasión vamos a hacer referencia a la “Separación por gradiente de densidad”, utilizaremos la centrifugación sobre una solución de densidad definida como es el Ficoll-Hypaque (Lymphoprep). El Ficoll es un polímero de carbohidrato y metrizamida (compuesto denso que contiene yodo) y que permite que se hundan los eritrocitos y los granulocitos (debido a su mayor densidad = 1.077), y que floten las células mononucleares (linfocitos y monocitos); por ello, que tras la centrifugación nos será fácil obtener las células mononucleares de sangre periférica para nuestro estudio (Fig. 1).
MATERIALES
- Tubos cónicos para centrífuga de 15 mL estériles (06 tubos)
- Tubo cónico de plástico de 50 mL estéril (01 tubo)
- Probetas de vidrio 50 mL (02)
- Ficoll-Hypaque (Lymphoprep™) (20 mL)
- Suero Fisiológico estéril (50 mL)
- Pipetas de 10 mL estériles
- Pipetas Pasteur de plástico estériles
- Parafilm
- Guantes de látex o vinilo estériles
- Bombilla de pipeteo (pipettus aid)
- Gradilla
- Centrífuga
- Campana de flujo laminar (en caso de no disponer de una, disponer de un ambiente donde trabajar con la máxima esterilidad posible)
PROCEDIMIENTO
- Importante tener Ficoll-Hypaque a temperatura ambiente.
- Durante todo el procedimiento trabajar con las máximas medidas de esterilidad y bioseguridad, de ser posible dentro de campana de flujo laminar o ambiente dispuesto para tal procedimiento.
- Limpiar superficie de trabajo con etanol 70% y calzarse guantes y bata de laboratorio. Si no se trabaja en campana de flujo laminar utilizar además gafas como medida de seguridad contra salpicaduras de sangre.
- Dispensar 20 mL de suero fisiológico en probeta de vidrio estéril y cubrir hasta su uso.
- Dispensar 20 mL de Ficoll-Hypaque en probeta de vidrio estéril y cubrir hasta su uso.
- Colocar los cuatro tubos cónicos de centrífuga en gradilla y dispensar 4 mL de Ficoll-Hypaque en cada tubo utilizando pipeta milimetrada.
- En tubo de 50 mL aparte, mezclar 18 mL de sangre con 18 mL de suero fisiológico utilizando pipetas milimetradas.
- Cargar 8 mL de sangre diluida con suero fisiológico en pipeta milimetrada y dispensar muy cuidadosamente y lentamente sobre el Ficoll-Hypaque en el tubo de centrifuga. Poner el tubo inclinado y apoyar la punta de la pipeta sobre la pared del tubo para dejar deslizar la sangre suavemente sobre el Ficoll y poder formar una interfase (Ficoll abajo y sangre arriba).
- Repetir la acción en cada uno de los tubos de centrífuga que contienen Ficoll. Se puede utilizar la misma pipeta.
- Cubrir todos los tubos y llevar a centrifugar.
- Centrifugar a 1500 r.p.m. durante 30 minutos, a temperatura ambiente y sin freno al final de centrifugación.
- Retirar cuidadosamente de la centrifuga y llevar a la gradilla. Verificar la formación de las fases de gradiente de densidad (arriba el plasma sanguíneo, debajo la banda de células mononucleares, debajo el Ficoll-Hypaque, debajo las células PMNs y debajo los eritrocitos aglutinados).
- Extraer toda la banda de células mononucleares utilizando pipetas pasteur de plástico y dispensar en tubo de centrifugación nuevo. Dispensar las cuatro bandas en un único tubo de centrifugación y luego completar hasta 15 mL con suero fisiológico. Cubrir tubo y llevar a centrifugación.
- Centrifugar con contrapeso a 1500 r.p.m. durante 10 minutos, a 4ºC pudiendo utilizar freno al final de la centrifugación.
- Extraer tubo de la centrífuga sin agitarlo.
- Decantar sobrenadante y resuspender células del fondo con un pulso de vórtex o con golpes con las yemas de los dedos.
- Completar nuevamente hasta los 15 mL con suero fisiológico, cubrir tubo y llevar nuevamente a centrifugar igual que en el paso anterior.
- Centrifugar con contrapeso a 1500 r.p.m. durante 10 minutos, a 4ºC pudiendo utilizar freno al final de la centrifugación.
- Decantar sobrenadante y resuspender células del fondo con un pulso de vórtex o con golpes con las yemas de los dedos.
- Agregar 2 mL de Medio de cultivo completo, cubrir tubo y agitar para resuspender células en el medio de cultivo.
- Contar células.
Finalmente en el contaje de células es un paso importante porque es necesario tener ajustado el número de células a una cantidad de 1 millón de células por mL, el contaje se realiza en cámara de Neubabuer y con Azul de Tripán. Luego de tener ajustado el número de células se procede al cultivo de las células mononucleares para poder realizar los estudios funcionales de estos tipos celulares.
